3 façons de faire la méthode de coloration de Gram

2024 Auteur: Jason Gerald | [email protected]. Dernière modifié: 2023-12-16 11:11

La coloration de Gram est une technique rapide et est utilisée pour voir la présence de bactéries dans un échantillon de tissu et pour classer les bactéries comme Gram-positives ou Gram-négatives, en fonction des propriétés chimiques et physiques de leurs parois cellulaires. La coloration de Gram est presque toujours utilisée comme première étape dans le diagnostic d'une infection bactérienne.

Cette technique de coloration porte le nom du scientifique danois Hans Christian Gram (1853 - 1938), qui a développé la technique en 1882 et l'a publiée en 1884 comme technique permettant de distinguer deux types de bactéries présentant des symptômes cliniques similaires: Streptococcus pneumoniae (également connu sous le nom de Streptococcus pneumoniae). pneumocoques) et la bactérie Klebsiella pneumoniae.

Étape

Méthode 1 sur 3: Préparation de la lame de microscope

Étape 1. Préparez-vous à travailler dans le laboratoire

Portez des gants et une longue cravate pour éviter la contamination bactérienne de l'échantillon que vous testez. Nettoyez l'espace de travail sous une hotte aspirante ou dans un autre endroit bien ventilé. Vérifiez le bec Bunsen et assurez-vous que le microscope fonctionne correctement avant de commencer.

Étape 2. Stérilisez la lame de verre du microscope

Si la lame de verre est sale, lavez-la à l'eau savonneuse pour éliminer l'huile et la saleté. Nettoyez les lames avec de l'éthanol, un nettoyant pour vitres ou une autre méthode utilisée par votre laboratoire.

Étape 3. Placer l'échantillon sur la lame de verre

Vous pouvez utiliser la technique de coloration de Gram pour aider à identifier les bactéries dans un échantillon médical ou une culture de bactéries se développant dans une boîte de Pétri. Pour de meilleurs résultats, utilisez la coloration de Gram sur des traits fins de l'échantillon. Il est conseillé d'utiliser des échantillons de moins de 24 heures, car les bactéries plus anciennes peuvent avoir endommagé leurs parois cellulaires et peuvent ne pas répondre à la coloration de Gram.

Si vous utilisez un échantillon de tissu, ajoutez 1 à 2 gouttes sur une lame de verre. Étaler uniformément sur la lame pour former une fine couche de saupoudrage d'échantillon, en la faisant glisser à l'aide du bord de l'autre lame de verre stérile. Laissez sécher avant de passer à l'étape suivante.
Si vous prenez des bactéries dans une boîte de Pétri, stérilisez la boucle d'inoculation dans un bec Bunsen jusqu'à ce qu'elle brille, puis laissez-la refroidir. Utilisez la boucle pour faire couler de l'eau stérile sur la lame, puis stérilisez et refroidissez à nouveau avant de l'utiliser pour collecter un petit échantillon de bactéries. Après cela, remuez doucement.
Les bactéries préparées dans le bouillon doivent être à nouveau agitées à l'aide d'un vortex, puis prélevées avec la boucle d'ensemencement comme ci-dessus, sans ajout d'eau.
Si vous avez un échantillon d'écouvillon (généralement fait avec une petite poignée en coton), touchez et faites pivoter doucement l'écouvillon sur la lame.

Étape 4. Une température légèrement élevée peut faire un bon frottis

La chaleur retiendra les bactéries sur le dessus de la lame, de sorte qu'elles ne se dissolvent pas facilement pendant le processus de coloration. Tapotez rapidement la lame deux à trois fois sur un bec Bunsen ou chauffez la lame sur un chauffe-lame électrique. Ne pas surchauffer, l'échantillon peut être endommagé. Si vous utilisez un bec Bunsen, il devrait s'agir d'une flamme petite mais bleue au lieu d'une grande flamme orange.

Alternativement, un frottis peut également être fait avec du méthanol, en ajoutant 1-2 gouttes de méthanol à un frottis sec, en séchant le méthanol restant sur la lame en le laissant à l'air libre. Cette technique minimise les dommages cellulaires et fournit un fond d'image de diapositive propre

Étape 5. Placez la diapositive sur le bac à colorier

Les plateaux à coloration sont faits de métal, de verre ou de plaques de plastique peu profondes avec un filet doux recouvrant le dessus. Placez les lames sur ces filets, afin que le liquide que vous utilisez puisse s'écouler dans le bac.

Si vous n'avez pas de bac à colorier, vous pouvez placer une lame sur un bac en plastique pour imprimer des glaçons

Méthode 2 sur 3: Processus de coloration de Gram

Étape 1. Versez le liquide cristal violet sur le frottis

Utilisez une pipette pour vaporiser un échantillon de bactéries avec quelques gouttes de colorant violet cristal, également connu sous le nom de violet de gentiane. Laissez-le pendant 30-60 secondes. Le cristal violet (KV) se sépare en solution aqueuse en ions KV+ et chlorure (Cl-). Ces ions pénètrent dans les parois cellulaires et les membranes cellulaires des bactéries gram-positives et gram-négatives. L'ion KV+ interagit avec les composants chargés négativement des cellules bactériennes, donnant aux cellules une couleur violette.

De nombreux laboratoires utilisent le cristal violet "Hucker", qui contient de l'oxalate d'ammonium pour empêcher la précipitation

Étape 2. Rincez délicatement le Crystal violet

Inclinez la lame et utilisez une bouteille de lavage pour pulvériser un petit jet d'eau distillée ou du robinet sur la lame. L'eau doit couler sur la surface du frottis et ne doit pas être pulvérisée directement sur le frottis. Ne pas rincer excessivement. Il peut éliminer les taches chez les bactéries Gram positives.

Étape 3. Rincer le frottis avec de l'iode, puis rincer

Utilisez un compte-gouttes pour rincer le frottis avec de l'iode. Laissez agir pendant au moins 60 secondes, puis rincez soigneusement de la même manière que ci-dessus. L'iode, sous forme d'ion chargé négativement, interagit avec le KV+ pour former un grand complexe composé entre le cristal violet et l'iode (complexe composé CV-I) dans les couches interne et externe de la cellule. Ce complexe de composés conservera la couleur violette du cristal violet à l'intérieur de la cellule, aux endroits colorés.

L'iode est une substance corrosive. Éviter l'inhalation, l'ingestion ou le contact avec la peau

Étape 4. Ajoutez de l'eau de Javel, puis rincez rapidement

Un mélange 1:1 d'acétone et d'éthanol est généralement utilisé pour cette étape importante, qui doit être soigneusement chronométrée. Positionnez la lame à un certain angle, puis ajoutez de l'eau de Javel jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de violet visible dans l'eau utilisée pour le rinçage. Cela prend généralement moins de 10 secondes, voire moins de temps si l'eau de Javel contient une forte concentration d'acétone. Arrêtez immédiatement cette étape, sinon le colorant lixiviera également le cristal violet des cellules gram-positives et négatives, et le processus de coloration doit être répété. Rincez immédiatement tout excès d'eau de Javel en utilisant la technique précédente.

L'acétone pure (plus de 95 %) peut être utilisée comme substitut. Plus vous utilisez d'acétone, plus l'eau de Javel agira rapidement, vous devez donc faire plus attention au timing.
Si vous avez du mal à garder une trace du temps pour cette étape, ajoutez de l'eau de Javel goutte à goutte.

Étape 5. Saupoudrez le contre-colorant sur le frottis, puis rincez

Un contre-colorant, généralement de la safranine ou de la fuchsine, est utilisé pour augmenter le contraste entre les bactéries gram-négatives et gram-positives, en colorant les bactéries décolorées (décolorées), c'est-à-dire les bactéries gram-négatives, roses ou rouges. Laisser pendant au moins 45 secondes, puis rincer.

La fuchsine colorera intensément de nombreuses bactéries à Gram négatif, telles que Haemophilus spp et Legionella spp. Cette méthode est bonne pour les débutants

Étape 6. Séchez la lame

Vous pouvez les faire sécher à l'air libre, ou les sécher à l'aide de papier absorbant vendu à cet effet, la coloration de Gram est terminée.

Méthode 3 sur 3: Vérification des résultats de coloration

Étape 1. Préparez le microscope optique

Placer la lame sous le microscope. Les bactéries varient considérablement en taille, de sorte que le grossissement total requis variera de 400x à 1000x. Un objectif avec de l'huile d'immersion est recommandé pour une image plus nette. Déposez l'huile d'immersion sur la lame, en évitant tout mouvement lors de l'égouttement pour éviter la formation de bulles. Déplacez la poignée de la lentille du microscope de sorte que la lentille de l'objectif s'enclenche et touche l'huile.

L'immersion dans l'huile ne peut être utilisée que sur des lentilles spécialement conçues, pas sur des lentilles « sèches »

Étape 2. Essayez d'identifier les bactéries à Gram positif et à Gram négatif

Examinez la lame au microscope optique. Les bactéries à Gram positif apparaissent de couleur violette, car le violet cristallin est piégé dans l'épaisse paroi cellulaire. Les bactéries à Gram négatif seront de couleur rose ou rouge, car le cristal violet est rincé à travers les fines parois cellulaires, où pénètre le contre-colorant rose.

Si l'échantillon est trop épais, le résultat peut être un faux positif. Colorer un nouvel échantillon s'il montre toutes les bactéries à Gram positif, pour s'assurer que le résultat est correct.
Si vous utilisez trop d'eau de Javel, le résultat peut être un faux négatif. Colorer un nouvel échantillon s'il montre toutes les bactéries à Gram négatif, pour s'assurer que le résultat est correct.

Étape 3. Comparez les résultats que vous voyez avec l'image de référence

Si vous ne savez pas à quoi ressemblent les bactéries, étudiez la collection d'images de référence, généralement triées par forme et coloration de Gram. Vous pouvez également consulter les bases de données en ligne sur [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos, et de nombreux autres sites en ligne. Pour faciliter l'identification, vous trouverez ci-dessous des exemples de bactéries couramment rencontrées ou importantes pour le diagnostic, classées selon leur statut Gram et leur forme.

Étape 4. Identifiez les bactéries à Gram positif en fonction de leur forme

Les bactéries sont en outre classées en fonction de leur forme au microscope, le plus souvent en cocci (sphériques) ou en bâtonnets (cylindriques). Voici quelques exemples de bactéries gram-positives (de couleur violette) selon leur forme:

Cocci à Gram positif généralement des staphylocoques (c'est-à-dire des cocci du groupe) ou des streptocoques (c'est-à-dire des cocci en chaîne).
« Bâtonnets à Gram positif tels que Bacillus, Clostridium, Corynebacterium et Listeria. La bactérie en bâtonnet Actinomyces spp. ont généralement des branches ou des filaments.

Étape 5. Identifiez les bactéries à Gram négatif

Les bactéries à Gram négatif (de couleur rose) sont souvent classées en trois groupes. Les coques sont de forme sphérique, les bâtonnets sont longs et minces, tandis que les bâtonnets coccoïdes sont intermédiaires.

Cocci à Gram négatif Le plus commun est Neisseria spp.
Bâtonnets à Gram négatif par exemple E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, et bien d'autres. Vibrio cholerae peut être vu comme une tige régulière ou une tige courbée.
Bactéries en bâtonnets à Gram négatif « coccoïdes » (ou « coccobacilles ») par exemple Bordetella, Brucella, Haemophilus et Pasteurella

Étape 6. Vérifiez soigneusement si les résultats sont mitigés

Certaines bactéries sont difficiles à colorer avec précision, en raison de la fragilité ou de la nature cireuse de leurs parois cellulaires. Ces bactéries peuvent présenter un mélange de violet ou de rose dans la même cellule, ou entre différentes cellules dans le même frottis. Les échantillons bactériens de plus de 24 heures peuvent montrer ce problème, mais il existe également certaines espèces bactériennes qui restent difficiles à colorer à tout âge d'échantillonnage. Ces bactéries nécessitent des tests plus spécialisés pour l'identification, tels que la coloration acido-résistante, l'observation en culture bactérienne, les milieux de culture TSI ou les tests génétiques.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium et Propionibacterium spp. toutes sont des bactéries gram-positives, mais ne sont souvent pas clairement colorées.
De petites bactéries minces telles que Treponema, Chlamydia et Rickettsia spp. difficile à colorer par la méthode de Gram.

Étape 7. Jetez tous les consommables et équipements restants

Cette procédure d'élimination des déchets varie d'un laboratoire à l'autre et dépend des matériaux utilisés. En règle générale, le liquide dans le bac de coloration est éliminé dans des bouteilles étiquetées comme déchets dangereux. Faire tremper les lames dans une solution d'eau de Javel à 10 %, puis les jeter dans un conteneur pour objets tranchants.

Des astuces

N'oubliez pas que les résultats de la coloration de Gram ne seront bons que si l'échantillon est bon. Il est important d'informer les patients afin qu'ils puissent fournir un bon échantillon (par exemple, la différence entre cracher versus une toux profonde pour obtenir un échantillon d'expectoration).
En tant qu'agent de blanchiment de couleur, l'éthanol réagit plus lentement que l'acétone.
Respecter les réglementations de laboratoire standard pour assurer la sécurité.
Utilisez un coton-tige pour vous entraîner, car il contient à la fois des bactéries gram-positives et gram-négatives. Si vous ne voyez qu'un seul type de bactérie, vous utilisez peut-être trop ou pas assez d'eau de Javel.
Vous pouvez utiliser des fermoirs en bois pour fixer la glissière.

Avertissement

L'acétone et l'éthanol sont des substances inflammables. L'acétone enlèvera l'huile de vos mains, ce qui permettra à votre peau d'absorber plus facilement d'autres produits chimiques. Portez des gants et utilisez-les avec précaution.
Ne laissez pas le frottis sécher avant de rincer la coloration de Gram ou la contre-coloration.